O processo de encistamento ocorre em muitos protozoários, e pode ser considerado como uma etapa obrigatória do ciclo de vida de vários organismos. Os cistos são, em geral, considerados como formas de dormência desenvolvidas pelos organismos quando em condições desfavoráveis. Por esse motivo, esse processo apresenta elevada importância evolutiva e ecológica, uma vez que garante a sobrevivência da espécie. Nos tripanosomatídeos, grupo de protozoários que compreende espécies patogênicas para o homem tais como Trypanosoma cruzi e Leishmania sp., o encistamento é exclusivo dos gêneros Blastocrithidia e Leptomonas. Contudo, o pequeno número de cistos originados em cultura é um fator limitante para a obtenção de maiores informações sobre a biologia e estrutura desses organismos. Os fatores que induzem o encistamento são pouco conhecidos e podem variar consideravelmente entre os protozoários. O objetivo do presente estudo foi verificar a influência de fatores físico-químicos (pH e osmolaridade) sobre o processo de encistamento de Leptomonas sp. Células de Leptomonas wallacei foram crescidas em meio complexo de Roitman a 28ºC. Utilizando-se HCl 1 N, foram preparados meios com diferentes valores de pH ( 5,0; 5,5 e 6,0) em relação ao meio controle (pH = 7,2), e um meio com maior concentração de KCl (5%), em relação ao meio controle (2%). Foram então realizadas curvas de crescimento, determinando-se o número de células em intervalos de 24 horas (contagem em câmara de Neubauer), em cada condição ensaiada. Em cada ponto da curva de crescimento, uma alíquota foi retirada para a confecção de esfregaços em lâminas. As lâminas foram coradas pelo método de Giemsa e observadas em microscópio ótico, com objetiva de 100X, determinando-se então o número de formas císticas. O número de células apresentando cistos aderidos no meio controle (pH 7,2 e 2% de KCl) representou 2% do total. O mesmo valor foi encontrado nos meios com pH 5,5 e 6,0 e no meio com maior concentração de KCl. Entretanto, o percentual de formas císticas observado em meio com pH 5,0 foi maior, representando 10% das células na cultura. O número total de células após 96 horas de cultivo, não sofreu alterações nos diferentes meios, permanecendo em torno de 2x10⁸ células/ml. Os resultados apresentados no presente trabalho demonstram que o pH do meio de cultivo influencia o processo de encistamento de L. wallacei. Deste modo, a modificação do pH do meio de cultura pode ser utilizada como estratégia para se aumentar a quantidade de cistos nesses organismos. A influência do pH no processo de encistamento de outros protozoários, incluindo Giardia sp., já foi descrito anteriormente. Ensaios envolvendo o cultivo de L. wallacei em meios com menores valores de pH (2,0; 3,0; e 4,0) bem como em meios mais alcalinos (pH 7,5; 8,0 e 8,5) estão sendo realizados.

¹ IniciaçãoCientífica, Acadêmico do Curso de Farmácia, Bolsista do PIBIC/EFOA

² Laboratório de Microbiologia, Departamento de Ciências Biológicas - EFOA

Especialidade: 2.12.01.00-5 Biologia e Fisiologia dos Microorgnaismos

INFLUÊNCIA DA COMPOSIÇÃO LIPÍDICA, EM MEIOS DE CULTURA, SOBRE O CRESCIMENTO DE Malassezia furfur.

Malassezia furfur é levedura dimórfica, lipofílica encontrada na microflora normal da pele adulta humana e animal. Conhece-se pouco sobre seu metabolismo e requerimento nutricional, a não ser aspectos relacionados à dependência lipídica. A associação com o homem começa, geralmente, na puberdade: período de maturação das glândulas sebáceas, podendo ocasionar lesões provenientes de uma patologia conhecida como pitiríase versicolor. Sugere-se que a lipase de M. furfur desempenhe importante papel no crescimento celular e em relação à patogenicidade. Sabe-se que a liberação de enzimas e a formação de ácidos graxos livres precedem o crescimento da cultura, o qual é melhor efetuado em presença de ácidos graxos insaturados gerados durante incubação. O trabalho tem como objetivo cultivar a levedura em meio basal contendo diferentes concentrações de algumas fontes oleosas de origem vegetal e analisar a curva de crescimento, massa fúngica e viabilidade celular.O estudo foi realizado com três amostras de M. furfur provenientes da micoteca do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMT 01, IMT 02, IMT 03). Foram promovidas variações na concentração da composição lipídica do meio, testando-se diversas fontes oleosas a 1%, 3%, 5%: óleos de oliva (Olea europaea L), canola (Brassica napus L.), milho (Zea mays), girassol (Helianthus annus L) e soja (Glycine max L). No intuito de analisar a interferência específica tanto em termos qualitativos quanto quantitativos de ácidos graxos componentes de cada uma das fontes oleosas testadas, prepararam-se meios de cultura contendo apenas tais fontes como únicos fornecedores de carbono para a levedura. As culturas foram mantidas à temperatura de 37C, em estufa. O crescimento da levedura pode ser verificado nas diferentes fontes oleosas, principalmente, na concentração de 3%. A amostra IMT 01 cresceu em todos os meios testados, sendo os maiores índices de crescimento observados em óleo de canola e os menores índices em óleo de soja. A amostra IMT 02 apresentou

pequeno crescimento em relação às outras testadas; seu crescimento pode ser melhor verificado em meio contendo óleo de soja, ao passo que meios compostos por óleo de milho possibilitaram baixo crescimento. A amostra IMT 03 apresentou elevado índice de crescimento, sendo as maiores proporções em meio composto por óleo de oliva e as menores em meio composto por óleo de girassol. Até o momento, foi possível concluir, através de diversos testes realizados, que leveduras do gênero Malassezia apresentam crescimento diferenciado conforme a fonte lipídica utilizada no meio de cultura. Tal variação do índice de crescimento pode ser confirmada através do teste de viabilidade escolhido neste estudo.

^{1 IniciaçãoCientífica,} Bolsista do PIBIC/CNPq

^{2 O}rientador

Departamento de Ciências Biológicas, Escola de Farmácia e Odontologia de

Alfenas - EFOA

Protozoários tripanosomatídeos encontram-se amplamente distribuídos na natureza, sendo observados em uma grande variedade de hospedeiros. Entre os insetos, a maioria das espécies de tripanosomatídeos monoxênicos são encontradas nas ordens Diptera e Hemiptera. O estudo da biologia dos tripanosomatídeos, incluindo o isolamento e a caracterização de novos isolados, usando diversos métodos novos, tem sido bem desenvolvido nas últimas décadas. Contudo, poucos trabalhos tem sido realizados sobre a interação desses protozoários e seus respectivos vetores. Assim, algumas questões ainda precisam ser respondidas tais como o papel dos flagelados no ciclo de vida dos insetos vetores e, por outro lado, o aparecimento de determinados estágios de desenvolvimento dos tripanosomatídeos (por exemplo, a forma opistomastigota, no gênero Herpetomonas), durante o ciclo natural da infecção. No presente trabalho, nós descrevemos os resultados preliminares de um estudo sobre a interação de tripanosomatídeos encontrados infectando naturalmente o díptero Chrysomya albiceps, em Alfenas, Minas Gerais. Cinco exemplares de C. albiceps foram capturados e examinados em laboratório para se detectar a presença de flagelados. O conteúdo intestinal dos insetos foi retirado com auxílio de alfinetes entomológicos e distendido sobre uma lâmina contendo solução salina. Preparações a fresco entre lâmina e lamínula do conteúdo intestinal dos insetos, foram examinadas em microscopia ótica de campo claro e mostraram que três dos cinco exemplares examinados apresentavam-se infectados com tripanosomatídeos. Os flagelados foram observados próximos aos túbulos de Malpighi (porém, não no interior dos tubos), livres na luz intestinal ou aderidos a extensões membranosas (membrana peritrófica). Preparações histológicas obtidas pela inclusão do conteúdo intestinal em parafina, seguida da obtenção de cortes em micrótomo e de coloração pelo método da hematoxilina-eosina, revelaram que os protozoários aderidos à membranas aparecem na forma de grandes grumos celulares contendo cerca de 50 células. Células envolvidas por membranas foram igualmente observadas através de microscopia eletrônica de transmissão (MET). Para a realização desta técnica, um dos conteúdos inestinais foi fixado em glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,2, e posteriormente, enviado ao Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, para as observações ultraestruturais. Em algumas imagens, estruturas semelhantes a endosimbiontes bacterianos puderam ser vistas. Atualmente, estamos tentando obter colônias dos vetores em laboratório para melhor caracterizar esse processo de interação parasita-células hospedeiras.

^{1 IniciaçãoCientífica,} Departamento de Ciências Biológicas da EFOA

² IniciaçãoCientífica , Laboratório de Fisiologia dos Microrganismos da UNIFENAS

³ IniciaçãoCientífica, Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ

⁴ IniciaçãoCientífica, Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ

⁵ Orientador

Afiliação: Pronex, CNPq e EFOA

Especialidade: 2.12.01.00-5 Biologia e Fisiologia dos Microorgnaismos

Examinou-se a atividade antimicrobiana de extratos vegetais hidroalcoólicos obtídos de Leonotis nepetaefolia, popularmente conhecida como cordão-de-frade, cordão-de-são-francisco, pau-de-praga, etc., e Leonorus cardíaca L., conhecida popularmente por chá-de-frade, erva-macaé, agripalma, etc.. A avaliação negativas: Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli, e as Gram positivas: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Enterococus.

Universidade de Alfenas - UNIFENAS

Instituto de Farmácia e Nutrição e Laboratórios de Microbiologia e Farmacognosia – UNIFENAS

Na natureza vários insetos hemípteros são portadores e transmissores de tripanosomatídeos para plantas e outros insetos que nelas vivem. Entre eles podemos citar os fitófagos Phitia pictia e o Nezara viridula. Os tripanosomatídeos Leptomonas, Herpetomonas, Crithidia e Phytomonas podem desenvolver na natureza um ciclo heteroxênico e multiplicar-se em vegetais, de grande interesse econômico, pois esses flagelados podem causar grandes prejuízos nas lavouras de feijão, soja, milho, tomates, uva, laranja, etc. O objetivo deste trabalho é avaliar o crescimento de Phytomonas serpens em tomates. Foram inoculados em cada tomate 105 células lavadas em soro fisiológico, com a finalidade de que o meio de cultura não induza falso resultado. Observou-se que inóculos de valor inferior ao citado não apresentou proliferação satisfatória. O crescimento foi estimado através da contagem de células em câmara de Neubauer. Devido ao grande número de detritos optou-se por não fixar as células em formalina, utilizando soro fisiológico a 4ºC, pois assim seria preservado o movimento flagelar, facilitando a identificação e contagem dos tripanosomatídeos. Obteve-se a seguinte curva de crescimento: 1,3 . 106 em 12 horas, 4,0 . 106 em 24 horas, 1,0 . 107 em 36 horas e 1,2 . 107 para 48 horas. Isto demonstra claramente que P. serpens cresce e multiplica no tomate utilizando seus constituintes como substratos. Estudos comparativos de crescimento in vitro encontram-se em andamento Apoio: CNPq - UNIFENAS – PRONEX.

¹ Iniciação científica - Bolsista Probic/UNIFENAS

² Iniciação científica - Acadêmica da Universidade de Alfenas

³ Pesquisadora - Prof. da Universidade de Alfenas

⁴ Pesquisador - Prof. da Escola e Farmácia e Odontologia de Alfenas, EFOA

⁵ Orientador - Prof. da Universidade de Alfenas

Instituição: Universidade de Alfenas – UNIFENAS

Especialidade: Protozoologia de Parasitos

O tripanosomatídeo Proteomonas brevicula foi isolado do inseto hemíptero Nabis brevis, por PODIPAEV e colaboradores na Rússia em 1990. Este protozoário desenvolveu-se em meio quimicamente definido, possibilitando desta maneira avaliar suas exigências nutricionais. De modo geral esses flagelados exigem pelo menos dez aminoácidos, sete vitaminas do complexo B, hemina, uma fonte de purina, oligoelementos e alguns intermediários do ciclo de Krebs. Neste trabalho o flagelado foi cultivado em meio definido de Roitman a 28ºC por 48 horas. Utilizando-se a técnica da omissão dos substratos, foi observado que este organismo exige os aminoácidos arginina, histidina, lisina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina e valina, bem como as vitaminas biotina, nicotinamida, piridoxamina, ácido fólico e riboflavina. Os aminoácidos isoleucina e leucina e as vitaminas pantotenato e tiamina foram apenas estimulantes do crescimento, mas não essenciais. Em adição foi observado que este protozoário cresce no meio isento de carboidratos no qual glicose, frutose, sacarose, estimularam o crescimento, enquanto, manitol e glicerol exerceram uma ação inibitória. Estes resultados sugerem um comportamento nutricional diferente dos demais tripanosomatídeos livres de endossimbiontes estudados até o presente. A investigação encontra-se em andamento no intuito da observação quanto às exigências de hemina, adenina e otimização dos parâmetros físico-químicos de crescimento. Apoio: CNPq - UNIFENAS – PRONEX.

¹ Iniciação Científica, Bolsista PROBIC/UNIFENAS

² Iniciação Científica, Acadêmica do Curso de Enfermagem

³ Pesquisadora - IOC - UFRJ - Rio de Janeiro - RJ

Instituição:

Universidade de Alfenas – UNIFENAS

Especialidade: Protozoologia de Parasitos

O kefir, uma suspensão de microorganismos simbiontes encapsulados por polissacarídios, tem sido um probiótico cada vez mais utilizado na medicina caseira, mas com poucos dados sobre a padronização de seu cultivo. Neste sentido, este trabalho busca estabelecer condições primárias para o cultivo de grãos de kefir, a fim de se possibilitar estudos quantitativos posteriores sobre aspectos de sua biologia, organização e ação terapêutica. Grãos hidratados de kefir com dimensões similares foram exaustivamente lavados em água destilada, sucedendo-se trituração com bastão de vidro em tubo de ensaio contendo tampão PBS, e introdução no compartimento maior de câmara de amostra de microcalorímetro de condução termal Analógica. No compartimento menor foram introduzidas soluções aquosas a 5.5 mM de glicose, sacarose e lactose, em diferentes ensaios. A câmara de referência foi preparada de modo similar, porém com tampão ao invés da suspensão de kefir. Após um período aproximado de 40 min para estabilização da linha de base, as câmaras foram manualmente agitadas com dispositivo próprio, e o perfil termogênico monitorado durante 2 hs. Independente do substrato energético utilizado, todos os perfis termogênicos apresentaram uma fase lag aproximada de 5 min sucedente à agitação das câmaras. Pouca responsividade térmica foi observada com glicose e sacarose, em comparação com lactose. Nesta última, um perfil bifásico das curvas de tensão versus tempo foi obtido com amostras diferentes do probiótico. A microcalorimetria mostrou-se potencial no acompanhamento metabólico de culturas de kefir, as quais apresentaram um perfil láctico característico de seus constituintes. Além disso, o perfil bifásico apresentado com lactose sugere uma ativação da síntese de galactosidases em presença de lactose, um quadro similar ao apresentado pela regulação do operon lac.

¹ Iniciação Científica

² Orientador

Instituição: CNPq, FAPEMIG, UNIFENAS.

Apoio: Lab. Bioquímica e Biologia Molecular - Unifenas.

Um tripanosomatídeo isolado de intestino de inseto foi classificado originalmente como pertencente ao gênero Crithidia, segundo critério estabelecido por PIRES (Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 92: 187, 1997). Contudo, este organismo foi reisolado em meio de cultivo bifásico denominado SNB9, realizado na República de Czeck (Polônia) e na Hungria, sendo sugerido que tal isolado pertence, de fato, ao mais novo gênero de tripanosomatídeos descrito por PODLIPAEV, incluindo duas novas espécies Proteomonas brevicula e Proteomonas inconstans. São protozoários pleomórficos mas que apresentam dentre as várias formas uma, incomum, semelhante a amêndoa, com estágio de diferenciação denominada endomastigota. P. inconstans, isolada de Calocoris sexgutatus (Hemiptera, Miridae) é um tripanosomatídeo que se desenvolve em meio de cultivo quimicamente definido possuindo formas arrendodadas ou elipsoidais, com a maioria apresentando flagelo livre. São subdivididos em 3 tipos morfológicos: células com organização promastigota, endomastigota e opistomastigota. A principal característica desta espécie celular está ligada à forma da bolsa flagelar e a disposição do núcleo e cinetoplasto. A bolsa flagelar apresenta dois grupos de microtúbulos. A divisão das células é realizada nos estágios promastigota e endomastigota. Entretanto, até o momento nenhum trabalho foi realizado sobre as exigências nutricionais destes tripanosomatídeos. Esta pesquisa objetiva estudar seu comportamento nutricional em meio quimicamente definido. Foram utilizados tubos com tampa metálica e incubação a 28ºC por 24h, tempo este determinado através da curva de crescimento realizada por um período de 96h. com determinações a cada 12h. Os inóculos continham cerca de 10 7 células e todas as medidas foram espectrofotométricas. Nestas condições, foi observado que, de todos os ácidos aminados e vitaminas componentes do meio definido, o flagelado em estudo não exige treonina; riboflavina, piridoxamina e biotina, exercendo apenas efeito estimulante. Também foi observado que o flagelado exige hemina e adenina para seu crescimento. Este comportamento nutricional é diferente de outros tripanosomatídeos. Investigações serão realizadas objetivando verificar a presença de um possível endossimbionte citoplasmático. O trabalho encontra-se em andamento e parâmetros físico-químicos serão avaliados.

¹ Iniciação Científica, Acadêmica da Universidade de Alfenas - UNIFENAS

² Pesquisadores, colaboradores.

³ Orientador, Professor da Universidade de Alfenas - UNIFENAS

Instituição: CNPq – UNIFENAS – PRONEX

¹ Iniciação científica – Bolsista Probic/UNIFENAS

² Iniciação científica - Acadêmica da Universidade de Alfenas

³ Pesquisadora - Prof. da Universidade de Alfenas

⁴ Pesquisador - Prof. da Escola e Farmácia e Odontologia de Alfenas, EFOA

⁵ Orientador - Prof. da Universidade de Alfenas

Instituição: Universidade de Alfenas – UNIFENAS

Especialidade:

A alveolite é uma das complicações mais freqüentes no pós-operatório das exodontias e provoca alterações no processo de reparo alveolar. A alveolite manifesta-se clinicamente através de dores intensas, pulsáteis e irradiadas que não cessam com o uso de analgésicos convencionais. As bactérias pertencentes à microbiota bucal têm sido responsabilizadas pelo processo e o uso tópico de antimicrobianos tem sido recomendado no intuito de prevenir e tratar esta patologia. O presente estudo tem como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana de uma pasta à base de rifamicina B dietilamina e da aderência proporcionada pela carboximetilcelulose (Supercorega pó®). Esta mistura foi colocada em cavidades realizadas nos meios de cultura inoculados com suspensões bacterianas em estudo. As placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas. Após o tempo de incubação as mesmas foram analisadas quanto à presença de halo de inibição do crescimento bacteriano produzido pelo antibiótico. Foi possível constatar, com base nos dados já obtidos, que apenas o antibiótico tem ação inibitória do crescimento bacteriano, quando do emprego isolado dos constituintes da pasta. A pasta mostrou-se eficiente quanto à inibição frente a todas as bactérias já testadas. Além disso, a mistura revelou-se pegajosa o suficiente para aderir ao alvéolo. Os resultados promissores de inibição antimicrobiana, propiciada pela pasta à base de rifamicina, mostram a possibilidade de utilização da mesma para o tratamento da alveolite, embora estudos em animais devam ser realizados.

(PIBIC-CNPq)

¹ Acadêmica do Curso de Odontologia da Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas

² Departamento de Clínica e Cirurgia da Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas

² Departamento de Microbiologia da Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas